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淺析幾種常見的PCR技術

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淺析幾種常見的PCR技術

發布日期:2018-08-22 作者:基因測序儀器 點擊:

淺析幾種常見的PCR技術

PCR是聚合酶鏈式反應的簡稱,是一種將幾個或幾十個拷貝數DNA片段擴增至上百萬份拷貝的方法。PCR技術發展至今已被廣泛應用于生物學基礎研究、物種鑒定、精準醫療、微生物檢測等多個領域,PCR技術服務也成為常見的分子生物學服務之一,分子生物學是從分子水平上闡明遺傳、生殖、生長和發育等生命特征的分子機理,從而為利用和改造生物奠定理論基礎和提供新手段

目前分子生物學在現代醫學檢驗中,主要有聚合酶鏈式反應(PCR)、分子生物傳感器、分子生物芯片技術、分子生物納米技術、分子蛋白質組學5項應用。分子生物學已經成為現代醫學領域不可或缺的診療手段之一,為疾病的診治提供了科學的技術保障,給患者帶來了很大的福音。美迪西在分子生物學、細胞生物學、體外生物學、結構生物學等生物學領域經驗豐富,可以通過酶水平、細胞水平測定等技術平臺幫助客戶進行化合物篩選及化合物特性、作用機制及生物標記物分析等研究,保證了客戶項目的有力實施,幫助客戶推進藥物研發的進程。

PCR技術作為一種常用的分子生物學技術,目前已經成為人們獲得目標基因的最常用的方法之一。PCR技術的基本原理并不復雜,主要包括模板DNA(目標DNA)加熱變性;降溫后反應混合物中特異性引物與單鏈DNA模板的復性;72℃條件下,Taq酶誘導引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一輪反應,模板拷貝數都增加一倍,理論上n次循環后,擴增產物拷貝數為2n-1。常見的PCR技術主要有以下幾種:

1、原位PCR( in situ PCR)技術

原位雜交細胞定位和PCR技術的有機結合,在組織或細胞水平直接對靶基因片段進行擴增,通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測。

原位PCR綜合了PCR 和原位雜交ISH的優點,是一種在組織切片或細胞涂片上原位對特定的DNA或RNA進行擴增,再用特異性的探針原位雜交檢測。細胞膜和核膜有一定的通透性,PCR擴增所需的各種成分可進入細胞內或核內,在原位對特定的DNA或RNA進行擴增。擴增產物由于分子量較大或互相交織,不易透過細胞膜向外彌散,故保留在原位。

原位PCR技術是細胞學科研與臨床診斷領域里的一項有較大潛力的新技術。它既能分辯帶有靶序列的細胞,又能標出靶序列在細胞內的位置,于分子和細胞水平上研究腫瘤的發病機理和臨床過程及病理的轉歸有重大的實用價值。基因測序儀器

2、錨定PCR(Anchored PCR,APCR)技術

原理:用酶法在一通用引物反轉錄cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列為引物結合位點對該cDNA進行擴增,稱為APCR。應用:它可用于擴增未知或全知序列,如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構建。

3、不對稱PCR(asymmetric PCR)技術

兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術稱不對稱PCR。在擴增循環中引入不同的引物濃度,常用50~100:1比例。在最初的10~15個循環中主要產物還是雙鏈DNA,但當低濃度引物被消耗盡后,高濃度引物介導的PCR反應就會產生大量單鏈DNA。

應用:可制備單鏈DNA片段用于序列分析或核酸雜交的探針。

4、反轉錄PCR(reverse transcription,RT- PCR)技術

當擴增模板為RNA時,需先通過反轉錄酶將其反轉錄為cDNA才能進行擴增。RT-PCR應用非常廣泛,無論是分子生物學還是臨床檢驗等都經常采用。

5、等位基因特異性PCR(Allele- specificPCR,ASPCR)技術

ASPCR依賴于引物3’- 端的一個堿基錯配,不僅減少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板復合物的熱穩定性。這樣有點突變的模板進行PCR擴增后檢測不到擴增產物,可用于檢測基因點突變。

6、復合PCR(multiplex PCR)技術

原理:在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段,如果基因的某一區段有缺失,則相應的電泳譜上這一區帶就會消失。

應用:復合PCR主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。

7、重組PCR技術

重組PCR技術是在兩個PCR擴增體系中,兩對引物分別由其中之一在其5’-端和3’-端引物上帶上一段互補的序列,混合兩種PCR擴增產物,經變性和復性,兩組PCR產物互補序列發生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發生聚合延伸反應,產生一個包含兩個不同基因的雜合基因。

8、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技術

這個也是大家非常熟悉的方法了,qPCR可用于研究基因表達,能提供特定DNA基因表達水平的變化,在癌癥、代謝紊亂及自身免疫性疾病的診斷和分析中很有價值。

9、競爭性PCR(competitive PCR,c-PCR)技術

c-PCR技術是競爭cDNA模板與目的cDNA同時擴增,使用同樣的引物,但一經擴增后,能從這些目的cDNA區別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板,其序列與目的cDNA序列相同,不過模板中僅有一個新內切位點或缺少內切位點。這種方法能精確測定mRNA中cDNA靶序列,可用于幾個到10個細胞中mRNA的定量。

10、巢式PCR(NEST PCR)技術

    先用一對靶序列的外引物擴增以提高模板量,然后再用一對內引物擴增以得到特異的PCR帶,此為巢式PCR。

    PCR技術在分子生物學領域已有四十多年的歷史,得益于全世界生命科學家對該技術的大量研究。在今后隨著分子生物學服務的開展,PCR技術將會更多的造福醫學研究。

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關鍵詞:基因測序儀器,培養箱,離心機

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